兔基质金属蛋白酶9(MMP-9) ELISA 试剂盒  96T/48T

简介

ELISA试剂盒在国内有许多种叫法，例如：ELISA检测试剂盒、ELISA Kit、酶联免疫试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒、酶联免疫分析试剂盒、酶免试剂盒等，比较常见的叫法是ELISA检测试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒等。

ELISA试剂盒自从60-70年代以来，得到科研工作者的认可及推崇，在欧美及获得很大的推广，尤其是国内生化领域的长足发展。

Elisa生物试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已应用在免疫学检验的各领域中。ELISA检测试剂盒适用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎（HEV）病毒 IgM 抗体ELISA检测。

原理

免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各种化学合成方法制备。近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂，各种新型使用的测定方法也不断出现。

HBsAg试剂特点（检测模式：临床抗体夹心法）：包被抗体为山羊多抗。多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。酶表抗体为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位，可测得HBsAg变异样品，提高检测的特异性（99.98%）提高检测的灵敏度，应用Parl Ehrich 学说（PEI）HBsAg标准品，对ad标准品的灵敏度为0.05ng/ml对ay标准品灵敏度为0.025ng/ml

ELISA检测试剂盒应用定性夹心免疫检测技术，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板条，这些多肽是型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很强的肽段，分别来自于该毒株的开放阅读框2和开放阅读框3。将样品或标准品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM抗体，这些抗体就会与HEV 的多肽抗原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根过氧化物酶）酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与次孵育结合上的HEV IgM抗体相结合，洗板除去未结合的酶结合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育时会发生酶-底物反应，只有那些含有HEV IgM抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入硫酸溶液终止酶和底物间的反应，并在波长: 450nm处测量O.D.值,按照本HEV IgM抗体elisa试剂盒的测试标准, O.D.值大于或等于Cut-Off值的样品被认为是初试阳性。

用途

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

然而，影响Elisa试验结果的因素很多，故加强各个环节的才能充分发挥其方法学的优点。

产品特点

一、灵敏、特异的抗体；

二、稳定的重复性和可靠性；

三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相载体；

四、适用血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等等多种标本类型；

五、节省实验经费。

elisa试剂盒回收率是反应待测物在样品分析过程中的损失的程度，损失越少，回收率越高，如果作标液1PPM，就是1毫克/升，而作出标准数据为0.99毫克/升，就是说你的回收率是99%，这个与真实成分有密切的关系，说明方法的准确度。比如水中总无机氯含量测定，样品水中含有无机氯20mg/L，取100mL被测水样品，加入0.1mL浓度为10mg/mL的含无机氯标准样品，测定时忽略体积变化，如果测定出样品中无机氯为29.8mg/L，则认为回收率为99%。

制备方法

包括以下步骤：

(1)抗原表位的计算机筛选；

(2)抗原的制备；

(3)血清的采集；

(4)间接ELISA方法的建立；

(5)间接ELISA方法的敏感性和特异性验证；

(6)试剂盒的稳定性验证；

(7)对屠宰场进行临床检测。该方法简单、快速、灵敏度高、特异性强、稳定性合格、重复性好。应用本发明制得的试剂盒能检出感染猪的戊型肝炎病毒，适用于大批量发病样本的检测，可用于猪戊肝的快速诊断，并预防、控制猪戊肝病毒的流行和阻断戊肝病毒由猪向人传播。

组成结构

1、 血清：操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。

2、 血浆：EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

3、 细胞上清液：1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4、 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液。

5、 保存：如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

此IBL试剂盒能用于小鼠血清,EDTA血浆,细胞上清中白介素-6的定量检测

兔基质金属蛋白酶9(MMP-9) ELISA 试剂盒  96T/48T

试剂盒成分

1 预包被板: 抗小鼠白介素-6兔子IgG,亲合纯化 96T

2 酶标记抗体: (30倍浓缩)HRP标记抗小鼠白介素-6兔子IgG,亲合纯化 0.4mL x 1

3 标准品: 重组小鼠白介素-6 0.5mL x 2

4 EIA缓冲液: 含1% BSA, 0.05%吐温20 BPS 30mL x 1

5 标记抗体稀释液: 含1% BSA, 0.05%吐温20 BPS 12mL x 1

6 显色剂: TMB底物液 15mL x 1

7 终止液: 1N硫酸 12mL x 1

8 浓缩洗涤液: (40倍浓缩) 含1% BSA, 0.05%吐温20 BPS 50mL x 1 操作说明 1实验所需器材(但试剂盒没有提供) 酶标仪(450nm) 微移液管及其吸嘴 量筒及烧杯 去离子水 冰箱(4°C) 坐标纸(log/log) 吸水纸 试管(用于标准品稀释) 温育箱(37°C ± 1°C) 洗瓶 (用于洗板) 一次性试剂管(用于浓缩酶标记抗体和显色剂)

操作方法

双抗体夹心法

1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。

2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小时，洗涤。

4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。

5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

间接法

1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜；

2.次日洗涤3次；

3.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤；

4.（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml；

5.37℃孵育35-60分钟，洗涤；

6.’后一遍用DDW洗涤。

其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

发展前景

临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。分子生物学正在并终肯定会让对整个生命科学有一个全面而的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又的，对以前一些难以检测的生物活性物质的测定，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。

主要设备

试剂

（1） 包被缓冲液（PH9.60.05M碳酸盐缓冲液）:

Na2CO3 1.59克

NaHCO3  2.93克

加蒸馏水至1000ml

（2） 洗涤缓冲液（PH7.4PBS）：0.15M

KH2PO4  0.2克

Na2HPO4·12H2O 2.9克

NaCl 8.0克

KCl 0.2克

Tween-20 0.05% 0.5ml

加蒸馏水至1000ml

（3） 稀释液：

牛血清白蛋白（BSA） 0.1克

加洗涤缓冲液至100ml

或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10%使用。

（4） 终止液（3M  ）：

蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7ml。

（5） 底物缓冲液（PH5.0枣柠檬酸）:

0.2MNa2HPO4（28.4克/L）25.7ml

0.1M柠檬酸（19.2克/L）  24.3ml

加蒸馏水50ml。

（6） TMB）使用液:

TMB（10mg/5ml无水乙醇）0.5ml

底物缓冲液（PH5.5）  10ml

0.75%H2O2   32μl

（7） ABTS使用液:

ABTS 0.5mg

底物缓冲液（PH5.5）  1ml

3%H2O2   2μl

（8） 抗原、抗体和酶标记抗体。

（9） 正常人血清和阳性对照血清。

器材

（1） 聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。

（2） 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

（3） 4℃冰箱，37℃孵育箱。

兔基质金属蛋白酶9(MMP-9) ELISA 试剂盒  96T/48T

FOR RESEARCH USE ONLY.

NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.

Bacteria folic acid (FA) ELISA Kit instruction

Intended use

This FA ELISA kit is intended Laboratory for Research use only and is not for use

in diagnostic or therapeutic procedures.The Stop Solution changes the color from

blue to yellow and the intensity of the color is measured at 450 nm using a

spectrophotometer. In order to measure the concentration of FA in the sample, this

FA ELISA Kit includes a set of calibration standards. The calibration standards are

assayed at the same time as the samples and allow the operator to produce a

standard curve of Optical Density versus FA concentration. The concentration of

FA in the samples is then determined by comparing the O.D. of the samples to the

standard curve.

Sample collection and storages

Serum - Use a serum separator tube and allow samples to clot for 30 minutes

before centrifugation for 10 minutes at approximately 3000×g. Remove serum and

assay immediately or aliquot and store samples at -20℃ or -80℃.Avoid repeated

freeze-thaw cycles

Plasma - Collect plasma using EDTA or heparin as an anticoagulant. Centrifuge

samples for 30 minutes at 3000×g at 2-8℃ within 30 minutes of collection. Store

samples at -20℃or -80℃. Avoid repeated freeze-thaw cycles.

Cell culture supernates and other biological fluids - Remove particulates

by centrifugation and assay immediately or aliquot and store samples at -20℃or

-80℃. Avoid repeated freeze-thaw cycles.

Note: The samples shoule be centrifugated dequately and no hemolysis or

granule was allowed.

Materials required but not supplied

1. Standard microplate reader(450nm)

2. Precision pipettes and Disposable pipette tips.

3. 37 ℃ incubator

Precautions

1.

Do not substitute reagents from one kit to another. Standard, conjugate and

microplates are matched for optimal performance. Use only the reagents supplied by

manufacturer.上海笃玛生物科技有限公司

2.

Do not remove microplate from the storage bag until needed. Unused strips

should be stored at 2-8°C in their pouch with the desiccant provided.

3. Mix all reagents before using.

Remove all kit reagents from refrigerator and allow them to reach room temperature

( 20-25°C)

Materials supplied

Name

96 determinations

48 determinations

Microelisa stripplate

12*8strips

12*4strips

Standard

0.3ml*6tubes

0.3ml*6tubes

Sample Diluent

6.0ml

3.0ml

HRP-Conjugate reagent

10.0ml

5.0ml

20X Wash solution

25ml

15ml

Chromogen Solution A

6.0ml

3.0ml

Chromogen Solution B

6.0ml

3.0ml

Stop Solution

6.0ml

3.0ml

Closure plate membrane

2

2

User manual

1

1

Sealed bags

1

1

Note: Standard (S0 → S5) concentration was followed by:0,1.5,3,6,12,24 ng/ml

Reagent preparation

20×wash solution:Dilute with Distilled or deionized water 1:20.

Assay procedure

1. Prepare all r e a g e n ts before starting assay procedure. It is recommended that

all Standards and Samples be added in duplicate to the Microelisa Stripplate.

2. Add standard: Set Standard wells, testing sample wells. Add standard 50μl to

standard well.

3. Add Sample: Add esting sample 10μl then add Sample Diluent 40μl to testing

sample well; Blank well doesn’t add anyting.

4. Add 100μl of HRP-conjugate reagent to each well, cover with an adhesive strip

and incubate for 60 minutes at 37°C.

5. Aspirate each well and wash, repeating the process four times for a total of five

washes. Wash by filling each well with Wash Solution (400μl) using a squirt bottle,

manifold dispenser or autowasher. Complete removal of liquid at each step is

essential to good performance. After the last wash, remove any remaining Wash

Solution by aspirating or decanting. Invert the plate and blot it against clean paper

towels.

6. Add chromogen solution A 50μl and chromogen solution B 50μl to each well.

Gently mix and incubate for 15 minutes at 37°C. Protect from light.

7. Add 50μl Stop Solution to each well. The color in the wells should change上海笃玛生物科技有限公司

from blue to yellow. If the color in the wells is green or the color change does not

appear uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.

8.

Read the Optical Density (O.D.) at 450 nm using a microtiter plate reader

within 15 minutes.

Calculation of results

1. This standard curve is used to determine the amount in an unknown sample.

The standard curve is generated by plotting the average O.D. (450 nm)

obtained for each of the six standard concentrations on the vertical (Y) axis

versus the corresponding concentration on the horizontal (X) axis.

2. First, calculate the mean O.D. value for each standard and sample. All O.D.

values, are subtracted by the mean value of the zero standard before result

interpretation. Construct the standard curve using graph paper or statistical

software.

3. To determine the amount in each sample, first locate the O.D. value on the

Y-axis and extend a horizontal line to the standard curve. At the point of

intersection, draw a vertical line to the X-axis and read the corresponding

concentration.

4. Any variation in operator, pipetting and washing technique, incubation time or

temperature, and kit age can cause variation in result. Each user should obtain

their own standard curve.

5. The sensitivity by this assay is 0.1 ng/ml

6. Standard curve

Storage： 2-8℃.

validity： six months.FOR RESEARCH USE ONLY; NOT FOR THERAPEUTIC OR

DIAGNOSTIC APPLICATIONS! PLEASE READ THROUGH

ENTIRE PROCEDURE BEFORE BEGINNING!